小核酸藥物是目前發(fā)展最為迅猛的基因療法之一,將帶來“除小分子藥和抗體藥"之外的第三次制藥浪潮。小核酸藥物包括反義寡核苷酸(ASO)、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、適配體(aptamer)等。其中,ASO藥物是小核酸藥物領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)最早、獲批最多的藥物類別,也是該領(lǐng)域研發(fā)的重要方向之一。
一、ASO藥物作用機制
反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)指與靶基因mRNA互補的一段單鏈DNA或RNA序列,長度通常為15-25nt,通過堿基配對原則與其互補的RNA結(jié)合,可以調(diào)節(jié)靶RNA的功能。ASO的作用機制主要分為兩大類:一類是基于RNase H1-介導(dǎo)的mRNA降解機制(圖1A所示);另一大類是基于ASO結(jié)合帶來的空間位阻,封閉mRNA關(guān)鍵區(qū)域,從而影響mRNA的成熟或者翻譯為蛋白質(zhì)(圖1B所示)。
圖1 ASO作用機制(圖片來源:Nature Reviews Drug Discovery, 2020, 19(10): 673-694)
二、ASO藥物體外代謝研究策略
和傳統(tǒng)小分子藥物一樣,在藥物臨床前研究階段,通常需要對ASO藥物進行體外代謝研究,并提供代謝途徑及其產(chǎn)物相關(guān)信息。ASO藥物的代謝酶主要為核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶,廣泛分布于血液和各個組織器官,一個合適的體外代謝研究體系,能夠最·大程度地預(yù)測體內(nèi)的情況,對于ASO藥物的早期篩選非常重要。表1所示為常用的ASO藥物體外代謝研究體系。
表1 ASO藥物的體外代謝研究體系
生物基質(zhì) | 試驗類型 | 備注 |
血清/血漿 | 代謝穩(wěn)定性,血漿蛋白結(jié)合試驗 | 金屬螯合劑抗凝的血漿不適合代謝穩(wěn)定性研究;ASO藥物血漿蛋白結(jié)合試驗可選擇超濾法和超速離心法。 |
肝S9 | 代謝穩(wěn)定性,代謝產(chǎn)物鑒定 | 肝S9一定程度上可以代替肝組織勻漿使用。 |
肝微粒體 | 代謝穩(wěn)定性 | 肝微粒體的核酸酶活性較低,但也有文獻報道人肝微粒體也能代謝ASO化合物。 |
肝組織勻漿 | 代謝穩(wěn)定性,代謝產(chǎn)物鑒定 | 酶體系比較全面,推薦用于ASO藥物的體外篩選評價。 |
肝細胞 | 代謝產(chǎn)物鑒定,細胞攝取試驗 | 肝細胞酶體系最為完善,適用于肝靶向的ASO藥物研究。 |
溶酶體 | 代謝穩(wěn)定性 | 溶酶體具有豐富的酶體系,包括核酸酶和各種水解酶等,是研究ASO藥物代謝穩(wěn)定性的高效實驗體系。 |
腦組織勻漿、腦脊液 | 代謝穩(wěn)定性,腦組織勻漿和腦脊液蛋白結(jié)合試驗 | 對于神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)肌肉適應(yīng)癥類的ASO藥物,可選擇腦組織勻漿和腦脊液進行體外相關(guān)研究。 |
需要指出的是,在藥物研發(fā)前期只用1-2個體外代謝體系去正確預(yù)測體內(nèi)穩(wěn)定性或代謝情況是非常困難的。因此建議在早期ASO藥物篩選時進行多體系代謝研究相互驗證,不斷優(yōu)化試驗方案,進而選擇與體內(nèi)相關(guān)性最佳的體外代謝體系進行篩選研究。
三、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品
為滿足客戶對于ASO藥物體外代謝研究的需求,IPHASE作為體外研究生物試劑引·領(lǐng)者,憑借先進的設(shè)備,專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗,開發(fā)出來多種用于ASO藥物體外代謝研究的產(chǎn)品,助力廣大客戶進行ASO藥物早期篩選研究。
類別 | 分類 |
亞細胞組分 | 肝溶酶體 |
酸化肝勻漿液 | |
肝/腸/腎/肺S9 | |
肝/腸/腎/肺微粒體 | |
肝/腸/腎/肺胞質(zhì)液 | |
原代肝細胞 | 懸浮肝細胞 |
貼壁肝細胞 | |
專屬血漿 | 血漿穩(wěn)定性 |
血漿蛋白結(jié)合 | |
空白生物基質(zhì) | 空白腦組織 |
空白腦脊液 |
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