體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)在化合物遺傳毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用日益廣泛。ICH S2(R1)已將肝臟彗星試驗(yàn)列為第2個(gè)組織/終點(diǎn)的體內(nèi)試驗(yàn);體內(nèi)哺乳動(dòng)物堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則(TG489)也已頒布。體內(nèi)堿性彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)DNA鏈斷裂、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)、不完整切除修復(fù)引起的DNA鏈的斷裂,能夠制成合適細(xì)胞懸液的組織DNA損傷。與其他試驗(yàn)相比其檢測(cè)的是單細(xì)胞水平的DNA損傷,因此該試驗(yàn)敏感性較高,操作簡(jiǎn)單,經(jīng)濟(jì)省時(shí)。
彗星實(shí)驗(yàn)(comet assay)也稱單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(single cell gel electrophoresis.SCGE),是一種有效評(píng)估DNA損傷的方法。其原理是器官或組織經(jīng)處理(如輻射、重金屬等)后,細(xì)胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂,經(jīng)細(xì)胞及其核膜裂解后,DNA解旋,在電場(chǎng)作用下,DNA 斷片遷移出細(xì)胞核,形成彗星狀的電泳圖譜。正常細(xì)胞的大分子DNA在電場(chǎng)作用下遷移距離較短,DNA仍保留在細(xì)胞核的范圍,形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同,可分為中性彗星實(shí)驗(yàn)(pH=8.4)和堿性彗星實(shí)驗(yàn)(pH>13)。中性彗星實(shí)驗(yàn)主要用于檢測(cè)DNA雙鏈的斷裂損傷,堿性彗星實(shí)驗(yàn)具有更高的靈敏性,可用于檢測(cè)更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。
需要注意的是,試驗(yàn)過程中的個(gè)方面,包括樣品準(zhǔn)備、電泳條件、視覺分析參數(shù)(如染色強(qiáng)度、顯微鏡光強(qiáng)度以及使用顯微鏡濾鏡和相機(jī)動(dòng)態(tài)和環(huán)境條件(如背景照明)已經(jīng)被研究,可能影響DNA遷移。
圖一:DNA損傷彗星細(xì)胞
圖二:正常細(xì)胞
TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay,2016,OECD Guideline for the Testing of Chemicals
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)證明能夠?yàn)樗褂玫哪繕?biāo)組織獲得足夠質(zhì)量的單細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液,從而在彗星試驗(yàn)(comet assay)中建立實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α?/font>匯智泰康擁有多年毒理學(xué)服務(wù)與產(chǎn)品研發(fā)經(jīng)驗(yàn),針對(duì)不同遺傳毒性試驗(yàn)開發(fā)針對(duì)試劑盒,包括彗星試驗(yàn)試劑盒。首先通過%尾DNA的評(píng)價(jià),對(duì)照處理組動(dòng)物%尾DNA在低范圍內(nèi)。目前的數(shù)據(jù)表明,尾部DNA百分比(基于平均中位數(shù))在大鼠肝臟應(yīng)該hao不要超過6%,這將是符合JaCVAM驗(yàn)證試驗(yàn)的值和其他出版和私有數(shù)據(jù)。目前還沒有足夠的數(shù)據(jù)對(duì)其他組織的jia或可接受范圍提出建議。這并不排除合理使用其他組織。測(cè)試報(bào)告應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)或?qū)S袛?shù)據(jù),對(duì)彗星試驗(yàn)在這些組織中的性能進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶彶椤J紫?,在?duì)照組中,需要一個(gè)較低的%尾DNA范圍,以提供足夠的動(dòng)態(tài)范圍來檢測(cè)陽(yáng)性的影響。其次,每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)能夠按照表1所建議的不同方式,對(duì)直接誘變劑和促進(jìn)劑的反應(yīng)。
表一:陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)及其部分靶組織
陽(yáng)性對(duì)照物 | 靶組織 |
Ethyl methanesulfonate | 任何組織 |
Methyl methanesulfonate | 肝臟、胃、十二指腸或空腸,肺和支氣管肺泡灌洗(BAL)細(xì)胞,腎臟,膀胱,肺,睪丸和骨骼骨髓/ |
Ethyl nitrosourea | 肝胃,十二指腸或空腸 |
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine | 胃、十二指腸或空腸 |
1,2-Dimethylhydrazine 2HCl | 肝臟和腸 |
N-methyl-N-nitrosourea | 肝臟,骨髓,血液,腎臟,胃、空腸和大腦。 |
應(yīng)收集陰性對(duì)照數(shù)據(jù),以證明陰性數(shù)據(jù)反應(yīng)的再現(xiàn)性,并確保對(duì)檢測(cè)的技術(shù)方面進(jìn)行適當(dāng)控制,或建議需要重新建立歷史控制范圍。
在實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證過程中,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立歷史數(shù)據(jù)庫(kù),建立相關(guān)組織和物種的陽(yáng)性和陰性對(duì)照范圍和分布。不同的組織和不同的物種,以及不同的給藥溶媒和給藥途徑,可能會(huì)產(chǎn)生不同的%尾DNA陰性對(duì)照值。因此,建立每個(gè)組織和物種的陰性對(duì)照范圍是很重要的。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用質(zhì)量控制方法,以確定其數(shù)據(jù)的變化程度,并表明該方法在其實(shí)驗(yàn)室中得到了“控制”??赡苓€需要優(yōu)化選擇適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照物質(zhì)、劑量范圍和實(shí)驗(yàn)條件(例如電泳條件),以便發(fā)現(xiàn)微弱的影響。
對(duì)實(shí)驗(yàn)方案的任何更改都應(yīng)根據(jù)其與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有歷史控制數(shù)據(jù)庫(kù)的一致性加以考慮。任何重大的不一致都應(yīng)導(dǎo)致建立新的歷史控制數(shù)據(jù)庫(kù)。
動(dòng)物準(zhǔn)備:動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。在開始實(shí)驗(yàn)前,這些動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件至少5天,給予標(biāo)識(shí)識(shí)別。試驗(yàn)開始時(shí),動(dòng)物的重量差異應(yīng)該不超過±20%。
樣品制備:在給動(dòng)物給藥前,固體測(cè)試化學(xué)品應(yīng)溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)?/font>溶媒中,或混合在飲食或飲用水中。液體試驗(yàn)化學(xué)品可直接加藥或在加藥前稀釋。對(duì)于吸入暴露,根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì),試驗(yàn)化學(xué)品可以作為氣體、蒸汽或固體/液體氣溶膠使用。
溶媒:在使用的劑量范圍內(nèi),溶媒不應(yīng)產(chǎn)生毒性作用,也不應(yīng)與試驗(yàn)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。如果使用的不是常用溶媒應(yīng)提供參考數(shù)據(jù),說明它們?cè)跍y(cè)試動(dòng)物、管理路線和終點(diǎn)方面的兼容性。建議在可能的情況下,應(yīng)首先考慮使用水性溶劑/溶媒。值得注意的是,一些溶劑可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),增加接觸部位DNA鏈斷裂的背景水平,尤其是與多藥給藥時(shí)。
陰性對(duì)照:陰性對(duì)照動(dòng)物,單獨(dú)用溶媒處理,其他處理方法與治療組相同,每一次采樣時(shí)間和組織的每次檢測(cè)均納入一組陰性對(duì)照動(dòng)物。陰性對(duì)照動(dòng)物的尾部DNA應(yīng)在每個(gè)組織預(yù)先設(shè)定的實(shí)驗(yàn)室背景范圍和該物種的取樣時(shí)間內(nèi)。
動(dòng)物數(shù)量和性別:目標(biāo)是每組提供至少5只可分析的單性別動(dòng)物,或如果使用兩種動(dòng)物,則每組至少提供5只可分析的單性別動(dòng)物。如果人類接觸到的化學(xué)物質(zhì)可能具有性別特異性,例如某些藥物,則應(yīng)在適當(dāng)?shù)男詣e下進(jìn)行檢測(cè)。三個(gè)劑量組和同時(shí)進(jìn)行的陰性和陽(yáng)性對(duì)照(每一組由5只單性別動(dòng)物組成),將需要25至35只動(dòng)物。
試驗(yàn)計(jì)劃:動(dòng)物應(yīng)接受為期2天或以上的每日給藥(即每隔約24小時(shí)進(jìn)行兩次或兩次以上),并在后一次治療后的2-6小時(shí)采集一次樣本。延長(zhǎng)劑量方案(如28天每日給藥)的樣本是可以接受的。測(cè)試化學(xué)品也可以分次使用,即,兩組給藥在同一天間隔不超過2-3小時(shí),便于給藥量大。在這種情況下,取樣時(shí)間應(yīng)根據(jù)后一次給藥的時(shí)間來安排。
劑量水平:對(duì)無毒試驗(yàn)化學(xué)品,給藥14天以上的,大(限)劑量為1000mg /kg體重/天。給藥時(shí)間少于14天,gao劑量為2000毫克/公斤體重/天。對(duì)于特定法規(guī)所涵蓋的特定類型的測(cè)試化學(xué)品(如人類藥物),這些限制可能有所不同。在長(zhǎng)期給藥后表現(xiàn)出毒物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)飽和或誘導(dǎo)排毒過程而可能導(dǎo)致接觸減少的物質(zhì),可能是劑量設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的例外,應(yīng)逐個(gè)進(jìn)行評(píng)估。
急性和亞急性的彗星試驗(yàn),除了大劑量(MTD,大可行的劑量,大接觸或限制劑量)遞減序列至少兩個(gè)額外的適當(dāng)間隔的劑量水平(hao相隔不到√10)應(yīng)該選擇為每個(gè)采樣時(shí)間證明劑量相關(guān)的反應(yīng)。但是,所使用的劑量水平也hao包括從大限度到產(chǎn)生很少或沒有毒性的劑量范圍。當(dāng)檢測(cè)到所有劑量水平的靶組織毒性時(shí),建議進(jìn)一步進(jìn)行無毒劑量的研究。為了更全面地調(diào)查劑量-反應(yīng)曲線的形狀,可能需要進(jìn)行研究。
在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí),應(yīng)考慮人體接觸的預(yù)期途徑。因此,暴露途徑,如飲食、飲水、局部、皮下、靜脈、口服(灌胃)、吸入、氣管內(nèi)或植入術(shù)可能是合理的。無論如何,應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)穆窂揭源_保目標(biāo)組織得到充分暴露。腹腔注射通常不推薦使用,因?yàn)樗皇堑湫偷娜梭w接觸的相關(guān)途徑,只能在有特定理由的情況下使用(例如,一些陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì),用于調(diào)查目的,或用于腹腔注射途徑所使用的某些藥物)。一次灌胃或注射液體的大容量取決于試驗(yàn)動(dòng)物的大小。體積不應(yīng)超過1毫升/100克體重,但可使用2毫升/100克體重的水溶液除外。如果動(dòng)物福利立法允許,使用比這更多的量是合理的。在可能的情況下,應(yīng)通過調(diào)整劑量配方的濃度來達(dá)到不同的劑量水平,以確保在所有劑量水平上的體積相對(duì)于體重是恒定的。
采樣時(shí)間:采樣時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵變量,因?yàn)樗怯蓽y(cè)試化學(xué)物質(zhì)在目標(biāo)組織中達(dá)到大濃度所需的時(shí)間和DNA鏈斷裂的誘導(dǎo)時(shí)間決定的,但在這些斷裂被移除、修復(fù)或?qū)е录?xì)胞死亡之前。彗星實(shí)驗(yàn)(comet assay)檢測(cè)到的一些導(dǎo)致DNA鏈斷裂的損傷持續(xù)時(shí)間可能很短,至少對(duì)于一些體外測(cè)試的物質(zhì)來說是這樣。因此,如果懷疑這種短暫的DNA損傷,應(yīng)采取措施減輕其損失,確保組織得到足夠早的采樣,可能早于下面給出的默認(rèn)時(shí)間。jia采樣時(shí)間可能是特定于物質(zhì)或路徑的采樣時(shí)間,例如,靜脈給藥或吸入給藥導(dǎo)致組織快速暴露。因此,在可能的情況下,應(yīng)根據(jù)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(如血漿或組織濃度達(dá)到峰值的時(shí)間(Tmax)或多次給藥的穩(wěn)態(tài)時(shí)間(Cmax)確定采樣時(shí)間。在缺乏動(dòng)能的測(cè)量數(shù)據(jù)合適的妥協(xié)基因毒性是樣品2-6 h后給藥兩次或兩次以上,或2-6和第16 - 26 h后。關(guān)于目標(biāo)器官中毒性作用外觀的信息也可用于選擇適當(dāng)?shù)娜訒r(shí)間。
組織收集:因?yàn)樗梢匝芯空T導(dǎo)的DNA鏈斷裂(彗星)在任何組織中,組織選擇應(yīng)清晰、基于收集的原因進(jìn)行研究與任何現(xiàn)有的基因毒性、致癌性或其他測(cè)試物質(zhì)的毒性數(shù)據(jù)在調(diào)查之中。應(yīng)考慮的重要因素應(yīng)包括給藥途徑、預(yù)測(cè)的組織分布和吸收、代謝的作用以及試驗(yàn)物質(zhì)可能的作用機(jī)制。肝臟是研究頻繁、數(shù)據(jù)feng富的組織。因此,在缺乏任何背景信息的情況下,如果沒有確定感興趣的特定組織,那么對(duì)肝臟進(jìn)行取樣是合理的,因?yàn)楦闻K是異種生物代謝的主要場(chǎng)所,而且常常高度暴露于母體物質(zhì)和代謝物中。在某些情況下,直接接觸部位的檢查(例如,口服藥物,胃腺或十二指腸/空腸,或吸入藥物,肺)可能是相guan的。應(yīng)根據(jù)進(jìn)行測(cè)試的具體原因選擇其他或替代組織,但如果實(shí)驗(yàn)室已證明對(duì)這些組織的熟練程度和同時(shí)處理多個(gè)組織的能力,對(duì)同一動(dòng)物的多個(gè)組織進(jìn)行檢查可能是有用的。
樣本制備:在后一次用測(cè)試化學(xué)品后的適當(dāng)時(shí)間,對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂。收集選定的組織,而同時(shí)采集同一組織的一部分,放置在甲醛溶液或適當(dāng)?shù)墓潭▌┛赡芙M織病理學(xué)分析。彗星實(shí)驗(yàn)的組織被放置在切碎緩沖液中,用冷切碎緩沖液充分沖洗以去除殘留的血液,并儲(chǔ)存在冰冷的切碎緩沖液中,直到處理完畢。原位灌注也可進(jìn)行,如肝、腎灌注。
玻片準(zhǔn)備:單細(xì)胞懸液制備后,應(yīng)盡快(hao在1小時(shí)內(nèi))制備載玻片,但動(dòng)物死亡與載玻片制備之間的溫度和時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制,并在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行驗(yàn)證。向低熔點(diǎn)瓊脂糖(通常0.5-1.0%)中加入細(xì)胞懸浮液的體積,使玻片的低熔點(diǎn)瓊脂糖百分比不應(yīng)降低到0.45%以下。jia的細(xì)胞密度將由用來給彗星評(píng)分的圖像分析系統(tǒng)決定。
細(xì)胞裂解:裂解條件也是一個(gè)關(guān)鍵變量,可能會(huì)干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內(nèi)收)導(dǎo)致的鏈斷裂。因此,我們建議在實(shí)驗(yàn)中對(duì)所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準(zhǔn)備好后,應(yīng)在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光),將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(shí)(或過夜),以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后,在堿液展開步驟之前,應(yīng)沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來完成。也可以使用電泳緩沖液。這將維持電泳室的堿性條件。
解旋和電泳:將載玻片隨機(jī)放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺(tái)上,使載玻片表面*覆蓋(每次覆蓋的深度也應(yīng)一致)。在其他類型的彗星試驗(yàn)電泳裝置,即主動(dòng)冷卻,循環(huán)和高容量電源,較高的解決方案覆蓋將導(dǎo)致更高的電流,而電壓保持不變。在電泳槽內(nèi)放置載玻片應(yīng)采用平衡設(shè)計(jì),以減輕槽內(nèi)任何趨勢(shì)或邊緣效應(yīng)的影響,并盡量減少批與批之間的差異,即,在每次電泳中,研究中每個(gè)動(dòng)物的載玻片數(shù)量應(yīng)相同,并應(yīng)包括來自不同劑量組(陰性和陽(yáng)性對(duì)照)的樣本。應(yīng)該留給DNA解旋至少20分鐘,然后進(jìn)行電泳受控條件下,測(cè)定的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍da化(即導(dǎo)致尾部DNA百分比的可接受水平的正面和負(fù)面的控制靈敏度da化)。DNA遷移水平與電泳時(shí)間線性相關(guān),也與電位(V/cm)線性相關(guān)。根據(jù)JaCVAM試驗(yàn),這可能是0.7 V/cm,持續(xù)至少20分鐘。電泳時(shí)間被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的變量,需要設(shè)置電泳時(shí)間來優(yōu)化動(dòng)態(tài)范圍。較長(zhǎng)的電泳時(shí)間(如30或40分鐘,以提高靈敏度)通常會(huì)導(dǎo)致較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)已知的誘變。然而,較長(zhǎng)的電泳時(shí)間也可能導(dǎo)致過度遷移的控制樣本。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中,電壓應(yīng)保持恒定,其他參數(shù)的變異性應(yīng)在一個(gè)較窄的指ding范圍內(nèi)。調(diào)節(jié)緩沖深度,達(dá)到要求,并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持。應(yīng)記錄電泳開始和結(jié)束時(shí)的電流。因此,jia條件應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室中與所研究的每個(gè)組織有關(guān)的熟練程度的初步演示期間確定。通過展開和電泳的電泳溶液的溫度應(yīng)保持在低溫下,通常為2-10oC(10)。
電泳完成后,將載玻片在中和緩沖液中浸泡/沖洗至少5分鐘。凝膠可以被染色并標(biāo)記為“新鮮”(例如在1-2天內(nèi)),也可以被脫水以便以后的標(biāo)記(例如在染色后1-2周內(nèi))。但是,這些條件應(yīng)該在熟練程度的展示過程中得到驗(yàn)證,并且應(yīng)該為每個(gè)條件分別獲得和保留歷史數(shù)據(jù)。如果是后者,則應(yīng)將玻片浸入無水乙醇中脫水至少5分鐘,風(fēng)干,然后儲(chǔ)存在室溫或冰箱容器中。
測(cè)量方法:彗星應(yīng)該使用自動(dòng)化或半自動(dòng)化的圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量評(píng)分。用合適的熒光染色劑對(duì)載玻片進(jìn)行染色,并在配備有超熒光和適當(dāng)檢測(cè)器的顯微鏡或數(shù)碼相機(jī)上進(jìn)行適當(dāng)放大(如200x)的測(cè)量。
根據(jù)彗星圖像圖譜的描述,細(xì)胞可以分為三種類型,即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的細(xì)胞(明確定義的頭部和尾部,不干擾相鄰的細(xì)胞)應(yīng)該為%的尾部DNA,以避免人為干擾。刺猬的頻率應(yīng)該根據(jù)每個(gè)樣本至少150個(gè)細(xì)胞的視覺評(píng)分(因?yàn)槿鄙僖粋€(gè)清晰定義的頭部意味著它們不容易被圖像分析檢測(cè)到)來確定,并單獨(dú)記錄下來。
所有用于分析的玻片,包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照的玻片,都應(yīng)獨(dú)立編碼并進(jìn)行“盲法”評(píng)分,以便評(píng)分者不知道情況。對(duì)于每個(gè)樣本(每個(gè)動(dòng)物的每個(gè)組織),至少應(yīng)該分析150個(gè)細(xì)胞(刺猬除外)。分析150細(xì)胞/動(dòng)物至少5動(dòng)物每劑,提供足夠的統(tǒng)計(jì)能力。
彗星DNA鏈斷裂可以通過尾DNA %、尾長(zhǎng)和尾力矩等獨(dú)立端點(diǎn)來測(cè)量。如果使用適當(dāng)?shù)膱D像軟件分析儀系統(tǒng),就可以進(jìn)行這三種測(cè)量。然而,推薦將%尾DNA(也稱為%尾強(qiáng)度)用于結(jié)果的評(píng)估和解釋,并由以細(xì)胞總強(qiáng)度百分比表示的尾DNA的片段強(qiáng)度決定。
在實(shí)驗(yàn)條件下,陽(yáng)性對(duì)照組的尾DNA%的與陰性對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的增加(p<0.05)時(shí),判定試驗(yàn)系統(tǒng)有效。
在試驗(yàn)系統(tǒng)判定有效的前提下,同時(shí)滿足以下三個(gè)條件,則判定受試樣品為陽(yáng)性結(jié)果:
(1) 尾DNA%的在某個(gè)單獨(dú)劑量組顯著升高;
(2) 尾DNA%隨試驗(yàn)樣品濃度升高有顯著增加趨勢(shì);
(3) 受試物組的尾DNA%全部超過陰性背景數(shù)據(jù)范圍。
在判定陽(yáng)性結(jié)果時(shí),如僅符合上述標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)或兩個(gè),除統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,還應(yīng)考慮其生物學(xué)意義。
如全部不符合上述3個(gè),則判定為陰性結(jié)果。
試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容:
(1)受試物來源如批號(hào);
(2)測(cè)試化學(xué)品的穩(wěn)定性、使用限制日期或已知的重新分析日期;
(3)化學(xué)識(shí)別,如IUPAC或CAS名稱、CAS編號(hào)、SMILES或InChI代碼、結(jié)構(gòu)公式、純度、雜質(zhì)的化學(xué)識(shí)別(視情況和實(shí)際可行)等。
(4)多組分物質(zhì),UVBCs和混合物, 盡可能用化學(xué)特性(見上文)、定量發(fā)生和表征化學(xué)成分的相關(guān)理化性質(zhì)。
(5)溶劑選擇的理由,已知測(cè)試化學(xué)品在溶劑/溶媒中的溶解性和穩(wěn)定性;劑量制劑的制備;對(duì)配方(例如穩(wěn)定性、均勻性、名義濃度)的分析測(cè)定;
(6)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:所使用的品種,以及作出選擇的科學(xué)和倫理理由;動(dòng)物的數(shù)目、年齡和性別;來源、居住條件、飲食、營(yíng)養(yǎng)等;試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)動(dòng)物的體重,包括每組動(dòng)物體重的范圍、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差;
(7)測(cè)試條件:陽(yáng)性和陰性控制數(shù)據(jù);測(cè)距研究的結(jié)果(如進(jìn)行);劑量水平選擇的理由;測(cè)試化學(xué)制劑的詳細(xì)資料;測(cè)試化學(xué)品的管理詳情;行政路線的基本原理;注射部位(用于皮下或靜脈注射研究);樣品制備方法,如有,組織病理學(xué)分析,特別是對(duì)彗星反應(yīng)陽(yáng)性的物質(zhì);
(8組織選擇的基本原理;
如果檢測(cè)結(jié)果為陰性,則驗(yàn)證該測(cè)試化學(xué)品是否達(dá)到目標(biāo)組織或一般循環(huán)的方法;
根據(jù)膳食/飲用水試驗(yàn)化學(xué)濃度(ppm)和消耗量(如適用)計(jì)算的實(shí)際劑量(mg/kg體重/日);
飲食及水質(zhì)詳情;詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)方案和取樣計(jì)劃以及選擇的理由(如有毒物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù));-止痛、鎮(zhèn)痛方法;-安樂的方法;分離和保存組織的程序;制備單細(xì)胞懸液的方法;所有試劑的來源和批號(hào)(如有可能);評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的方法;電泳條件;使用染色技術(shù);評(píng)價(jià)和測(cè)量彗星的方法;
(9)結(jié)果:對(duì)每只動(dòng)物在試驗(yàn)前和整個(gè)試驗(yàn)期間進(jìn)行一般臨床觀察(如有);進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)的證據(jù);超過一周的研究:研究期間的個(gè)體體重,包括各組體重范圍、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差; 劑量-反應(yīng)關(guān)系明顯;對(duì)于每個(gè)組織/動(dòng)物,%的尾部DNA(或其他測(cè)量方法,如果選擇)和每張玻片的中位數(shù),每只動(dòng)物的平均值和每組的平均值;同步和歷史陰性對(duì)照數(shù)據(jù),包括評(píng)估的每個(gè)組織的范圍、平均值/中位數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差;并發(fā)和歷史正控制數(shù)據(jù);對(duì)于肝臟以外的組織,使用陽(yáng)性對(duì)照的劑量-反應(yīng)曲線。
(10)應(yīng)用的統(tǒng)計(jì)分析和方法;
(11)討論結(jié)果和結(jié)論
彗星試驗(yàn)試劑盒
北京匯智泰康針對(duì)堿性彗星試驗(yàn)開發(fā)彗星試驗(yàn)試劑盒,本試劑盒提供了彗星試驗(yàn)(單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn))需要的主要試劑盒耗材,省去了細(xì)胞裂解液、細(xì)胞懸液、堿性電泳液、電溶膠配制等時(shí)間,可以直接使用,大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期;試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和多次試驗(yàn)驗(yàn)證,符合堿性彗星試驗(yàn)要求,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。
堿性彗星試劑盒應(yīng)用廣泛,可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒性檢測(cè)評(píng)價(jià)。
【產(chǎn)品說明】
本試劑盒提供了單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(single cell gel electrophoresis,SCGE)需要的試劑和耗材。
包裝盒 | 產(chǎn)品組成 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 保存條件 |
堿性彗星實(shí)驗(yàn)盒 | 細(xì)胞裂解液 | 500 mL | 1 | 室溫 |
電泳膠A | 10 mL | 1 | 室溫 | |
電泳膠B | 15 mL | 1 | 4℃ | |
玻片 | 2孔 | 25 | 室溫 | |
EDTA | 12.5mL | 1 | 室溫 | |
核酸染料 | 10 ul | 1 | 4℃ | |
DMSO | 50 mL | 1 | 室溫 |
【試劑盒應(yīng)用范圍】
本試劑盒應(yīng)用范圍非常廣,可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝 材料等遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。
【傳統(tǒng)試驗(yàn)操作不足】
【試劑盒優(yōu)勢(shì)】
便捷—— 本試劑盒省去了裂解液配制時(shí)間,可以直接使用,大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。
【產(chǎn)品使用說明】
干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、雙穩(wěn)定電泳儀、電泳槽、倒置熒光顯微鏡和低速冷凍離心機(jī)等。
實(shí)驗(yàn)開始前,請(qǐng)根據(jù)說明書要求自行準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需試劑及耗材。
PBS緩沖液配制(1 L) | ||
試劑A | 12.07 g | 溶解后,先調(diào)pH至7.4,再定容至1L。 |
超純水 | 定容至1L | |
細(xì)胞懸液制備緩沖液配制(1 L) | ||
PBS緩沖液 | 900mL | 混合均勻后,4℃保存?zhèn)溆谩?/span> |
試劑B | 100mL | |
細(xì)胞裂解液配制(500 mL) | ||
試劑C | 445 mL | 使用時(shí),先加入5 mL試劑D混勻,再加入50 mL DMSO混勻。 |
試劑D | 5 mL | |
DMSO | 50 mL | |
電泳膠準(zhǔn)備 | ||
電泳膠 | 90~100℃水浴溶膠5 min | 37 ℃保存20 min后待用。 |
堿性電泳液配制(1 L) | ||
試劑B | 5 mL | 使用時(shí),先將試劑B、E*溶解后,再定容至1 L, 4℃保存?zhèn)溆谩?/span> |
試劑E | 8 g | |
超純水 | 定容至1L |
注:可根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際需求改變?cè)噭┑呐渲屏俊?/font>
(1)懸浮細(xì)胞:細(xì)胞懸浮液經(jīng)離心分離獲得。將細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的速度懸浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。
(2)貼壁細(xì)胞:輕輕從皿底分離細(xì)胞。將細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管中,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用1X PBS (不含Ca+和Mg+)冰洗一次。將細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的速度懸浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。
(3)組織制備:稱取組織約0.05 g,加入制備緩沖液(含20 mmol/L EDTA-Na2的PBS)立即剪碎,沖洗。迅速研磨組織,過濾,整個(gè)過程在冰上操作。離心重懸,計(jì)數(shù)單細(xì)胞懸液密度約在為1×105~4×105個(gè)/mL。
(1)取120μL濃度為電泳膠A趁熱鋪于磨砂載玻片上,形成底膠,用蓋玻片推勻,不能有氣泡,4℃凝固20min。
(2)水平取下蓋片,取80 μL電泳膠B與20μl細(xì)胞懸液混勻,立即鋪片,加上蓋玻片,4℃凝固5min,形成第二層膠。再取80μL電泳膠B鋪在第二層膠上,4℃凝固5min,形成第三層膠。保證細(xì)胞均勻分布于每孔,每個(gè)樣本平行2孔。
(3)細(xì)胞裂解
將玻片置于平皿中,加入預(yù)冷的裂解液(裂解液:DMSO=10:1),4℃過夜裂解,裂解液平面剛好沒過玻片表面。裂解后,倒掉裂解液,用超純水清洗3次,5min/次。
4、解旋
加入預(yù)冷的解旋液(pH>13)沒過玻片,4℃避光解旋1h。
5、電泳
預(yù)先將電泳槽置于冰盒內(nèi),冷卻備用。將解璇后的細(xì)胞玻片置于電泳槽,倒入電泳液,調(diào)整電壓 22-24V,電流約為300Ma,電泳20min。電泳結(jié)束后,取出玻片,輕輕擦拭,去除多余液體。
超純水清洗2遍,無水乙醇脫水1遍,5min/次。37℃烘干。
染色時(shí)將稀釋過的Gene Red : Tris-Hcl 1:6000,加到玻片每孔表面,每孔100μL,避光染色30分鐘。超純水清洗3遍,去除多余液體,37℃烘干或室溫避光晾干。
拍照前關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室光源,使用CASP1.2.3beta2彗星圖像分析軟件進(jìn)行分析,每只動(dòng)物都要分析150個(gè)可分析的尾DNA含量百分率的中位數(shù)。分析過程中如遇刺猬細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。
【注意事項(xiàng)】
1.本試劑盒僅供科研使用,不可用于診斷程序。
2.實(shí)驗(yàn)開始前,請(qǐng)自行準(zhǔn)備DMSO、超純水、手術(shù)器械、篩網(wǎng)、無水乙醇、染色液、水平電泳槽等。
3.使用組織進(jìn)行彗星試驗(yàn)時(shí),需注意細(xì)胞制備需全程在冰上進(jìn)行,且保證在1 h內(nèi)完成鋪片。
4.電泳膠使用時(shí)需提前水浴融化,禁用微波。
5.因各實(shí)驗(yàn)室條件不同,各種激發(fā)光源所需染色液各異,本試劑盒未提供染色液。推薦的染色液包括但不局限于Gene Red、SYBR Green、SYBR Gold等。
6.清洗玻片時(shí)注意不要直接將液體傾倒至膠面,防止脫膠。
圖1 陽(yáng)性對(duì)照 圖2 陰性對(duì)照
注:附圖僅供參考,以實(shí)際為準(zhǔn)。
常見問題及原因分析
1. 大鼠麻醉處死后,取肝臟樣品制備要注意肝的保存溫度及保存時(shí)間、冷凍組織以及一些其他諸如取樣所用緩沖溶液、所取肝臟組織大小等因素。取好的肝臟在制成單細(xì)胞懸液前多在冰上保存1h。一半彗星實(shí)驗(yàn)所取的肝臟大小約為0.05cm³。
2. 如需將組織冷凍,應(yīng)將組織取出后迅速并深度冷凍,直至制備單細(xì)胞懸液時(shí)取出。
3. 解旋時(shí)間會(huì)影響DNA尾百分?jǐn)?shù),DNA尾百分?jǐn)?shù)隨著解旋時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)。
4. 電泳時(shí)間會(huì)影響DNA尾百分?jǐn)?shù),細(xì)胞DNA遷移隨著電泳時(shí)間的增長(zhǎng)二增長(zhǎng)??梢酝ㄟ^改變電壓提高試驗(yàn)的靈敏度,推薦電壓為0.7V/cm。
5. 如有其他技術(shù)問題,可聯(lián)系匯智泰康。
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